药物开发是一个逐步递进的过程，对动物和人体有效性和安全性的研究评价随着开发进程不断往前推进。生殖毒性是药物非临床安全性评价的重要组成部分。在药物开发的过程中，通过动物生殖毒性试验来反映所研究药物对哺乳动物功能和发育过程的影响，预测其可能产生的生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺育乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎仔发育、出生后发育的不良影响，从而在限定临床试验受试者范围、降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用[1、2]。
生殖毒性试验常规采用的试验方案为三段式试验方案，即生育力与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段）、胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）、围产期毒性试验（Ⅲ期）。三段式试验通过在不同阶段的给药和不同的观察指标，来全面观察对生殖整个过程的影响。在药物开发的不同阶段，基于风险的大小可分阶段提供生殖毒性试验资料以支持不同阶段的临床试验。
关于生殖毒性试验的阶段性要求，我国于2006年发布的《药物生殖毒性研究技术指导原则》中，从保障受试者安全性角度出发，结合我国临床研究风险控制及非临床研究风险识别的特点，要求：通常情况下在Ⅰ期临床试验开始前提供完整的Ⅰ段、Ⅱ段生殖毒性试验资料，以期在临床研究开始前尽可能了解受试物对雌雄动物生殖能力、生殖器官、生殖细胞以及胚胎发育的影响；围产期毒性试验资料可在上市申请时提供。
中国于2017年加入ICH后，对申请临床试验和上市的生殖毒性的阶段性要求可参考照ICH M3（R2）指导原则，基于生殖毒性担忧的大小，与临床试验过程中严格的生殖毒性风险控制措施，分阶段提供支持相应临床试验阶段的生殖毒性试验。这其中，生殖毒性的担忧与拟进行临床试验的期限、样本量和入组受试者人群特点有关。本文阐述ICH M3（R2）中支持不同药物开发阶段的生殖毒性试验要求，以及在该指导原则实施过程中需要关注的问题。
支持不同药物开发阶段的生殖毒性试验要求[3]
ICH M3（R2）中规定针对不同的开发阶段和临床试验中拟纳入的人群，在适当的时间进行生殖毒性试验。
男性受试者
在重复给药毒性试验中对雄性生殖器官进行了详细检查（包括全面的组织病理学检查），雄性生育力试验完成前，男性受试者可以纳入Ⅰ、Ⅱ期临床试验。
雄性生育力试验应在大规模或长期的临床试验开始前完成。大规模或长期的临床试验，包括但不限于III期临床试验，视临床方案确定，如大于150人或时间超过3个月。
女性受试者
无生育可能的妇女
无生育可能妇女定义为绝育或绝经后妇女。绝经后定义为在无替代医疗措施的情况下停经12个月。
如果在重复给药毒性试验中对雌性生殖器官进行详细检查，无生育可能妇女在缺少动物生殖毒性试验的情况下可纳入临床试验。
妊娠妇女
在妊娠妇女纳入临床试验前，各项生殖毒性试验和遗传毒性标准试验组合均应完成。另外，还应对药物以往人体暴露的安全性数据进行评价。
有生育可能的妇女（WOCBP）
对于有生育可能的妇女，在潜在风险与获益信息获得之前，对胚胎或胎儿的非预期暴露具有较高水平的担忧。当临床试验中纳入WOCBP时，对胚胎或胎儿非预期暴露风险进行表征并将风险降至最小化非常重要。
Ⅱ段生殖毒性试验
为使胚胎或胎儿风险降至最低，有两种方法。第一种方法是进行生殖毒性试验以表征药物本身的固有风险，并在临床试验WOCBP的暴露过程中采取适当的防控措施。第二种方法是临床试验过程中通过采取避孕措施以控制风险，此时胚胎-胎仔发育影响的评价可延迟至Ⅲ期临床试验前完成（视临床试验规模和时间）。
避孕措施包括：①妊娠检测（如测定β-HCG）、采用高效的避孕方法，并仅在证实月经期后进入试验。②进行受试者教育。试验期间的妊娠检测和受试者教育，应足以确保受试者在整个药物暴露期间（并可能超过临床试验期限）能够依从为避免妊娠而设计的措施。为支持这些避孕措施，应基于任何现有与生殖毒性相关的信息起草知情同意书，如具有相关结构或药理学作用的药物的潜在毒性的综合评价。如果无相关生殖毒性信息，应与受试者交流告知药物对胚胎或胎儿存在未知风险。
在某些特殊情况下，在未进行动物发育毒性试验（如胚胎-胎仔试验）时，WOCBP也可纳入早期临床试验。一种情况是在短期（如2周）临床试验中加强妊娠风险控制。另一种情况是疾病在女性中高发，不纳入WOCBP无法有效地达到临床试验目的，且有足够的预防措施以避免妊娠（具体措施见上述）。
在缺乏动物发育毒性试验的情况下，临床试验纳入WOCBP，还需考虑的其他因素包括对药物作用机制、药物类型、药物在胎儿暴露的程度，或在合适的动物模型中进行发育毒性试验的难度的认识。例如，根据当前的科学认识，单克隆抗体在人类的器官发生期给药，胚胎-胎儿的暴露量较低，因此发育毒性试验可在Ⅲ期临床试验期间进行，在申请上市时应提交完整的试验报告。
通常情况下，若能获得在两种动物种属中进行的适当的初步生殖毒性数据，且在临床试验中采取严格的避孕措施，在最终的生殖毒性试验完成之前，临床试验中可纳入WOCBP（小于150人）进行相对短期（不超过3个月）的研究性给药。允许WOCBP进行该种规模和给药期限的试验，是基于此种规模和期限的严格控制的临床试验中受试者的妊娠概率非常低，而设计合理的初步生殖毒性试验能够检出临床试验纳入WOCBP时可引起担忧的大部分发育毒性发现。WOCBP的样本量和试验期限，可受到改变妊娠率的人群特征（如年龄、疾病）的影响。
Ⅰ段生殖毒性试验
在重复给药毒性试验中对雌性生殖器官进行了评价的前提下，在雌性生育力试验进行之前，多次给药的Ⅰ、Ⅱ期临床试验可以纳入WOCBP。为支持大规模或长期给药的临床试验（如Ⅲ期试验）纳入WOCBP，应完成专门的雌性生育力试验。
Ⅲ段生殖毒性试验
围产期生殖毒性试验应在申请上市时提交。
但是，在未采取有效避孕措施的WOCBP或妊娠状况不明的妇女纳入临床试验前，所有雌性动物生殖毒性试验和遗传毒性标准试验组合均应完成。
关注问题
随着ICH指导原则在国内落地实施，与之前一般在临床试验开展了I、II段生殖毒性试验相比，目前越来越多的品种在未进行正式的生殖毒性试验的情况下申请进行临床试验。但是，基于申报资料提交情况，发现存在一些认识的误区，例如认为早期临床试验不需要生殖毒性试验的支持，甚至有些申报资料直接在生殖毒性试验项下标注“不适用”，而未提供任何生殖毒性风险评估。实际上，生殖毒性试验适当延迟的前提条件是在已获得信息的基础上加上临床试验期间严格的控制措施，能控制临床试验受试者的生殖毒性风险。以下阐述几个需要重点关注问题。
重复给药毒性试验中生殖系统组织病理学检查的要求
ICH M3(R2)提出：在期限至少2周的重复给药毒性试验（通常为啮齿类动物）中对睾丸和卵巢进行全面标准（thorough standard）的组织病理学检查，用于对雌雄生育力进行评估，被认为与检测雌雄生殖器官毒性的生育力试验同样灵敏；因为重复给药毒性试验评估了药物对雄性生殖器官的影响，在雄性生育力试验完成前男性受试者可以入选Ⅰ、Ⅱ期临床试验；在重复给药毒性试验中对雌性生殖器官进行了评价的前提下，在雌性生育力试验进行之前，多次给药的Ⅰ、Ⅱ期临床试验可以纳入WOCBP。
对于M3(R2)中提出的生殖器官的检查要求，ICH S5(R2) [4]提出：良好的雄性动物生殖器官病理学和组织病理学检查（如通过Bouin’s液固定、石蜡包埋、睾丸2-4μm横切片，附睾纵切片，PAS-苏木素染色）是检查对精子发生的影响的一种更为敏感和快捷的方法。为了进一步证实其他试验方法所观察的试验结果或进一步阐述受试物的作用特点，精子分析实验（精子计数、精子活力、精子形态学）可作为一种可选方法而采用。在进行精子分析试验时，如果受检样品取自于输精管或附睾，这种精子分析试验结果对生育力的评价更具有相关性。
ICH对S5正在修订过程中，于2017年发布S5(R3)草案进行征求意见，该草案提出的相关要求为：重复给药毒性试验的全面的生殖器官组织病理学是检测大多数雄性和雌性生育力影响的敏感方法（动物是性成熟的）；如果使用重复给药毒性试验来评估生育力影响，应对雄性和雌性动物的生殖器官进行全面（comprehesive）的组织病理学检查；当基于作用方式或先前试验数据引起担忧时，可在重复给药毒性试验中包括附加的检测，例如精子收集和分析、监测发情或月经周期；如果其他试验的数据表明雄性或雌性生殖器官的重量或组织病理学有影响，则应考虑更全面的试验。[5]
目前审评中存在的一个常见问题是，申请人称根据ICH M3(R2)要求，因为已进行了重复给药毒性试验，要求在没有完成雄性和/或雌性生育力试验的情况下进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验，但是申请人往往忽略了一个重要问题，重复给药毒性试验对生殖器官影响的检查是否达到生殖毒性评价的要求。根据国内的研究现状，重复给药毒性试验中常常未充分关注生殖系统毒性评价，未能全面检测和评估。综合以上ICH所阐述的要求，拟通过重复给药毒性试验反映的生殖毒性试验信息，在设计重复给药毒性试验时要特别关注对生殖系统的影响，进行专门的设计。在重复给药毒性试验中是否可初步评价生育力的关键因素是：重复给药毒性试验中的生殖系统组织病理学检查结果的全面性、可靠性。需要达到的基本要求：①动物要性成熟，有足够数量；②组织病理学检查要全面，雄性：睾丸和附睾（含精子发生周期）的详细的定性镜检，精子阶段（分期）的定量分析可用于对已确定的影响的进一步表征研究；雌性：卵巢（包括卵泡、黄体、基质、间质、脉管系统）、子宫和阴道的详细的定性镜检等，并特别关注对原始和初级卵泡的定性评估。③此外，目前国内的组织病理学检查水平参差不齐，组织病理学的检查质量要经得起同行评议（必要时要求提供病理切片邀请病理学专家复阅查）。[6]
初步胚胎-胎仔发育毒性试验的要求
ICH M3(R2)中要求，通常情况下获得两种动物种属中的初步EFD试验（preliminary EFD，pEFD）结果，并在临床试验中采取严格避孕措施后，WOCBP可入组小规模、短时间的临床试验（小于150人、不超过3个月）。如果临床试验超过上述规模和时间，需要完成正式EFD试验。根据该要求，并非Ⅱ段试验直接延迟至Ⅲ期临床试验前，在几期临床试验前完成需要根据临床试验受试者规格和期限而定，而且需要初步EFD试验结果的支持。因此，需要充分认识初步EFD试验，并合理地去评价其结果对初步生殖风险评估的贡献。
M3(R2)对初步的胚胎-胎仔发育毒性试验要求为：应具有足够的剂量，包括对胎仔存活率、体重、外观和内脏检查的评价，每组至少6只母体动物，母体动物在整个器官生成给药。该初步的非临床试验应在符合高质量的科学标准且随时可获得数据采集记录的条件下进行，或在GLP条件下进行。[3]
因此，初步EFD（pEFD）试验并非简单的预试验，在设计上与正式的EFD试验相似，除每组动物略少、少个别指标、在保持试验质量的条件下可不严格遵从GLP外。在评价初步试验时，因其动物数有限，所以面对结果要谨慎评价（尤其阴性结果），如有其他相关的生殖毒性信息资料（如同类药物）可参考时，要尽可能地综合分析。
生育力试验雄性动物交配前给药时间的选择
对于Ⅰ段试验雄性动物交配前给药时间，国内生殖毒性指导原则[1、2]要求，生育力试验尤其是减少雄性动物交配前给药期，应根据前期试验所积累的资料以及对精子发生过程基础研究的再评价而设计。一般情况下为4～l0周。重复给药试验可提供受试物对精子发生的潜在影响的信息。如果在1个月以上的重复给药毒性试验中未发现任何毒副作用，在交配前雄性动物交配前给药时间可缩短至4周。
ICH S5(R2)指导原则[4]认为：对于给药时间，尤其是评价受试物对精子生成影响时，应利用已有的毒性研究资料（如组织病理学检查、生殖器官重量、在一些情况下的激素检测和遗传毒性数据）。如果在至少2周的重复给药毒性试验中未发现任何影响，交配前雄性动物给药2周便可。应说明选择给药时间的理由并提供依据。此外，针对其余试验资料提示可能有担忧或无资料时，ICH S5(R2)指导原则提出：如果其他的研究资料显示对雄性或雌性生殖器官重量或组织学有影响，或如果对试验检查结果的质量有疑问，或如果完全没有其他的研究资料，应考虑进行更全面研究的必要性。[4]
需要关注的是大鼠精子发生(包括精子成熟）整个过程需要63天（即9周），雄性交配前给药时间缩短为2周并不能覆盖整个生精周期。而且，雄性生育力试验可评价受试物对雄性生育力的功能性影响，这种功能性影响无法在重复给药毒性试验中用组织病理学的方法进行评价。因此，按照ICH指导原则要求执行（雄性动物交配前给药2周）时要关注其前提条件，一是要基于已有毒性试验中对雄性生育力影响的观察是否足够，二是重复给药毒性试验中未发现对雄性生殖毒性相关指标的任何影响，而这两点往往是现有申报资料中关注不够或未关注的。
综合考虑，对于雄性动物交配前给药时间的选择，应具体问题具体分析，兼顾科学性、合理性、风险效益评估，在规范、仔细的重复给药毒性试验（尤其雄性生殖器官组织学检查）未发现明显毒性反应结果的支持下可适当缩短交配前给药时间。对于同类品种提示有潜在生殖毒性风险的或毒性信息较少的创新药，建议采用较长的给药时间，并配合仔细的精子分析和生殖系统病理组织学检查。[7]
综合评价及临床试验风险提示
所有的生殖毒性试验最终都是为了人体的生殖/发育风险评估，最终的生殖/发育风险评估结论对于临床试验或临床应用中人体生殖发育风险的预防管控有着很高的指导价值。这需要在评估生殖发育风险时，要综合所有可用的数据（包括动物生殖毒性数据、其他毒性试验数据、可能有的临床安全性及药代数据、受试物作用机制靶标等背景信息、同类/相关药物审评经验或毒性提醒等），以及临床治疗的效益考虑，给出客观、谨慎、基于暴露的人体风险评估结论，并基于生殖毒性风险评估，提示临床试验应采取的生殖毒性风险控制措施。
ICH M3（R2）对避孕措施进行了阐述（见上文），包括通过受试者纳入限制、高效的避孕方法、试验期间的妊娠检测和受试者教育、知情同意书中的信息反映等，但是目前国内临床试验的避孕措施大多未达到此要求。而且，从临床试验实际情况看，确实存在风险控制措施不足而导致试验过程中妊娠或流产的事件发生。因此，无论是对于在无正式的生殖毒性试验进行临床试验，还是已有试验信息提示具有生殖毒性风险时，需按照ICH M3（R2）要求采用严格的生殖毒性风险控制，以保护好受试者安全性。
参考文献
[1]国家食品药品监督管理局.药物生殖毒性研究技术指导原则[S] .2006.
[2]王庆利, 黄芳华, 彭健,等.药物生殖毒性研究的考虑要点[J].中国新药杂志, 2007, 16(10): 737-739.
[3] ICH. M3 (R2) Guidance on nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals[EB/OL]. (2009-06-11). http://www.ich.org．
[4]ICH．S5(R2)：Detection of toxicity to reproduction for medicinal products & toxicity to male fertility [EB/OL]. （2005-11）．http://www.ich.org．
[5]ICH．S5(R3)（draft）：Detection of toxicity to reproduction for human pharmaceuticals[EB/OL]. （2017-07-05）http://www.ich.org．
[6]张立将，黄芳华。浅析ICH S5(R3)药物生殖毒性研究指导原则草案的新技术要求及其挑战。中国新药杂志,2018,27（18）: 2088-2097
[7]张立将，黄芳华、王庆利等，药物雄性生殖毒性评价考虑要点及FDA相关指导原则介绍，中国新药杂志,2016, 25(24) : 2766-2772