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OECD微生物农药中次级代谢物的风险评估

时间: 2022-05-23 来源: 《农药科学与管理》   作者: 宋俊华,王以燕,邢立国

微生物次级代谢物因其产生过程、条件以及自身性质的特殊性,对其进行风险评估是微生物农药登记评审中的难点,我国现行《农药登记资料要求》并未对该部分内容提出相关要求。经济合作与发展组织(OECD)2018年发布的98号工作文件(Working Document on the Risk Assessment of Secondary Metabolites of Microbial Biocontrol Agent)(以下简称“OECD98号文件”)对微生物农药中次级代谢物的风险评估进行了详细介绍,本文对其中的部分重点内容进行了总结和梳理,供管理部门制定相关政策及农药企业申请产品境外登记时提供参考。

微生物代谢物分为初级代谢物(Primary Metabolites)和次级代谢物(Secondary Metabolites 以下称为SM),前者是指微生物产生的,对其生长、扩展或繁殖必需的化合物,后者是指微生物产生的,对其生长、扩展或繁殖非必需的化合物,且次级代谢物由初级代谢物通过生化合成产生。相关次级代谢物(relevant secondary metabolite)是指对人类健康和/或环境可能构成一定危害的次级代谢物。

虽然对SM的管理通常参照化学农药的要求,但SM与化学农药代谢物不同之处在于:SM通常为一组化合物,其产生受其他生物或非生物因素的影响,或在微生物与寄主或靶标生物接触时才产生,部分为有效成分的组成部分。SM主要由放线菌和真菌产生,已经被确认的SM主要包括:真菌毒素(mycotoxin)、植物毒素(phytotoxin)、外毒素(exotoxin)和抗生素(antibotics)。在OECD98号文件中,SM不包括酶和内毒素。内毒素一般由革兰氏阴性菌产生,但苏云金芽孢杆菌也可产生内毒素,称为delta毒素,即具有杀虫活性的晶体蛋白,是该类产品生物活性及有效成分的一部分。

对微生物中SM的风险评估主要依赖基础信息、环境中暴露和持久性等数据进行。参照OECD对植物源农药的管理模式,为便捷对SM的管理,该工作文件依据现有信息将微生物农药分为以下3类:1.已知对人类、动物和环境无负面影响的微生物。2.根据分类及现有信息,可能产生对人类、动物和环境造成危害的SM的微生物,此种情况下需要对SM进行定性定量分析,如可产生真菌毒素的木霉菌(Trichoderma spp)。3.无可靠相关信息的微生物。

1. 基础信息

SM的风险评估从基础信息开始,其内容包括:1.产生SM的微生物的特性,包括鉴别和分类、生理习性、繁殖能力、作用机制、寄主范围、增殖条件和生产工艺、在环境或食品/饲料中的分布、生成和暴露,以及与已知能够产生相同SM菌种的相关性等。但同一SM可由相近或完全不同的菌种产生,因此对于一个全新的微生物农药,即使没有与已知可产生同一SM的菌种有关联,也不能完全排除其产生SM的可能性。2.微生物产品特性,包括产品剂型和详细的产品组成、防治作物和对象、使用时间和剂量等。3.SM的特性,包括结构和命名、存在于细胞里或外、产生的基因代码序列、稳定性、作用机制、对人类/哺乳动物或其他非靶标生物的影响、产生的环境条件及调节机制,以及对微生物产品作用机制的影响等。4.微生物与靶标生物的相关性,包括防治对象和药效数据等。5.微生物与非靶标生物的关系,包括微生物不属于有效抗生素和人类致病菌的信息、相关的医学报告以及非靶标生物清单等。此外,公开发表的相关信息以及QSAR数据等,也可作为对SM进行安全性评价的辅助数据。但用QSAR对SM使进行评估的难点在于,其往往无CAS号或SMILES码或准确的分子结构,或为一组混合物,因此无法获得QSAR模型的输入参数。对SM构效关系评价使用最多的为Norine 数据库,该数据库收录了1 000多种肽类化合物信息,涵盖化合物结构、活性、以及产生的有机物种类等。如基础信息足以证明微生物产品及其产生的SM的安全性,则无需对SM进行进一步的风险评估。

2. 环境中暴露和持久性

对SM的暴露评估主要依据产品剂型、有效成分含量、防治作物、推荐的使用剂量、使用方法、地点和时间以及SM在自然界中存在的浓度等信息进行。SM生成途径有2条:1是在微生物生产过程中产生;2是在前体分子中存在或与寄主或致病菌接触时产生。只有在前一种情况下,用微生物产品作为样品进行的相关试验才对评价SM的安全性有用。

表:不同的使用方式对应的、可能受SM影响的非靶标组

 

可能受影响的非靶标组

 

 

使用方法

 

 

土壤处理/浇灌和种子处理和颗粒剂

 

 

叶面喷雾

 

 

工人/操作者

 

 

 

 

 

 

消费者

 

 

 

 

 

 

路人/居民

 

 

X

 

 

 

 

哺乳动物/鸟

 

 

 

 

 

 

水生有机物

 

 

X

 

 

 

 

非靶标土壤节肢动物

 

 

 

 

X

 

 

非靶标叶面节肢动物

 

 

X

 

 

 

 

蚯蚓

 

 

 

 

X

 

 

土壤微生物

 

 

 

 

X

 

 

其他非靶标植物1

 

 

X

 

 

 

                 1如SM为植物毒素     

对SM的风险评估需同时考虑其稳定性和持久性。从现有的数据来看,昆虫病原真菌产生的SM有以下几个特点:1.在液体发酵介质中很快降解;2.在植物中不存在或含量低于检测限;3.仅在特定的条件下稳定;4.在使用现场因为温度和紫外线等因素很快分解。因此当暴露到正常环境条件下时,昆虫病原真菌产生的SM并不稳定。对于木霉菌和细菌等产生的SM,目前已知的信息还很少。但SM的稳定性并不能完全依据DT50/DT90的值来判定,因具有代谢活性的微生物在使用后仍可能继续产生SM。

3. 风险评估

对SM进行的风险评估涉及4个部分内容:1.毒性试验;2.膳食风险评估;3.职业风险评估;4.非靶标组风险评估。对于毒性试验部分,如前所述,只有SM在微生物生产过程中产生,即用于试验样品的微生物产品中含有该SM时,进行的相关试验才可用于SM评价。

在下列几种情况下需要对SM进行膳食风险评估:1.基础信息部分数据显示微生物产生的SM存在人体毒性风险;2.与已知产生真菌毒素的菌种相近(见工作文件8.2.1部分表3),因为真菌毒素可能有致癌性、致突变性或生殖毒性;3.与已知的人类致病菌相近(见工作文件8.2.2部分)。如有证据支持可能形成有害的SM,则需要按照下列步骤进行进一步评估:1.产生有害SM的基因序列是否存在;2.根据使用方法和剂型确定暴露可能性,其中叶面使用风险性最高,与之相比,因导致膳食暴露的可能性较低,土壤和种子处理剂则相对安全,如有充足理由证明SM不会构成职业、路人或居民风险或膳食风险,风险评估也可到此为止。否则继续以下步骤:3.确认使用过程中产生的SM浓度,此过程需要对SM进行定量或半定量分析。4.确定毒性数据。如无毒性相关数据,也可以用食品中污染物允许最大含量确定真菌毒素的含量是否可接受,如欧盟No1881/2006号条例中规定了食品中污染物的限量,美国、中国、新加坡和巴西等也都规定了真菌毒素在食品中的限量指标。或采用毒理学关注阈值(TTC)的方法,如基因毒性致癌物为1.5ug/人/天或25ng/kg体重/天。结合膳食消费数据,有可能计算出食品中所允许的最大量。但TTC对一些致癌性非常高的物质如黄曲霉素(aflatoxin)不适用。

职业工人和操作者也可能暴露于SM。主要暴露途径为经皮或吸入途径,而较少通过眼部或经口途径。如果经皮或吸入毒性较高,则需要进行定量的风险评估。如木霉菌产生的Trichothecenes为细胞膜破坏性毒素,可能造成皮肤损伤或系统性疾病。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为除草剂,也能够产生一系列的真菌毒素。对于在微生物生产过程中产生的SM,风险评估可以按照目前传统化学农药的方法进行。

对于SM的非靶标组风险评估,存在传统生态毒理试验的适用性、标准试验介质制备、提取程序标准化、试验数据重复性等多种问题,但可依据微生物及SM的相关特性申请豁免。如假单胞菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)的土壤和种子处理产品,因其会在植物根部形成一层生物膜,对非靶标组的暴露受到限制,另外,其生成的代谢物-脂肽通过破坏致病菌的细胞膜产生作用,可以排除其对非靶标组的潜在影响,且这些微生物均为土壤中普遍存在的,也不太可能对土壤中有重要环境或生态环境影响的物种构成风险。

由此可见,对微生物中次级代谢物的风险评估,较难制定统一的要求和流程,需要结合微生物、代谢物本身特性以及使用条件等多种情况而定,由于农药相关标准缺乏,部分限量要求还需参照食品中的限量要求执行,在工作文件8.3部分-全球已获登记的微生物农药产品清单(微生物农药电子手册中收录数据)中,也仅有少量明确了次级代谢物信息。因此,为鼓励微生物农药发展,结合现有微生物农药作用机制和应用场所等特点,如果明确不属于已知的人畜或脊椎动物病原体的微生物,或虽有研究表明其可能产生有害SM,但产生条件或使用方式导致其暴露的可能性很低,国家农药登记管理部门可考虑降低其风险评估要求,同时加强对新微生物品种的审批,对已知危害性较大的SM建立定性定量检测方法,在促进微生物农药发展的同时规范其管理。

该工作文件同时给出了其他有关SM的数据库信息,以及全球登记的产生真菌毒素的真菌农药清单、植物毒素清单(文献数据)和微生物农药电子手册2014版中收集的全球登记的微生物农药清单等,可为我国农药管理部门在制定次级代谢物管理相关政策时提供参考。